Differenzierungsverhalten von murinen Knochenzelllinien unter verschiedenen Einflüssen anhand der Expression knochenspezifischer Gene

Kurzfassung

Neben der fehlenden Schwerkraftkomponente stellt die erhöhte Strahlenexposition einen limitierenden Faktor für den Langzeitaufenthalt des Menschen im Weltraum dar. Vorraussetzung für eine detaillierte Untersuchung von strahlenbiologischen Effekten auf das Differenzierungsverhalten von Knochenzelllinien ist die Auswahl eines geeigneten Zellsystems. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Zellsystem bestehend aus Präosteoblasten, Osteoblasten und Osteozyten verwendet. Zunächst wurde eine umfassende Charakterisierung des Zellsystems durchgeführt. Die untersuchten murinen Zelllinien MC3T3-E1 S4, MC3T3-E1 S24, OCT-1 und MLO-Y4 wurden auf ihr Potential hin getestet, mineralisierte Knochenmatrix auszubilden. Die Zelllinien wurden aus diesem Grunde einerseits unter Standard-Kontrollbedingungen und andererseits unter „osteo“-induktiven Kultivierungsbedingungen kultiivert. Die Ausbildung von mineralisierten Bereichen innerhalb des Zellrasens gibt hierbei direkte Hinweise auf das Differenzierungspotential der verwendeten Zelllinie. Anhand der Expression von knochenzellspezifischen Markergenen, wie der alkalischen Phosphatase und Osteokalzin, erfolgte die Einteilung der Zelllinien in unterschiedliche Reifungsstufen. Die Zelllinie MC3T3-E1 S24 konnte daher eindeutig der Stufe des Präosteoblasten zugeordnet werden, während die Zelllinien OCT-1 und MC3T3-E1 S4 zu reifen Osteoblasten und die Zelllinie MLO-Y4 zu Osteozyten klassifiziert wurde. Nach der differenzierten Einteilung der Zelllinien in Differenzierungsstufen, erfolgten die strahlenbiologischen Untersuchungen. Die Zelllinien zeigen in der Reihenfolge MC3T3-E1 S24 > MC3T3-E1 S4 > OCT-1 > MLO-Y4 eine zunehmende Strahlenunempfindlichkeit (Koloniebildungstest). Die Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen und deren Reparatur (γH2AX-Immunfluoreszenz) ist in den untersuchten Zelllinien vergleichbar. Der Einfluss von ionisierender Strahlung auf die Zellzyklusprogression zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung zeigt sich als dosisabhängiger G₂-Zellzyklusarrest (PI-Durchflußzytometrie), welcher über die Regulierung der beiden Zellzyklusinhibitoren p21(CDKN1A) und p16(INK4A) verfolgt werden konnte. Als spezifischer später Marker der Knochenbildung und Mineralisierung kann die Hochregulierung in der Osteokalzin Genexpression nach Bestrahlung als Anhaltspunkt für eine Induktion des Differenzierungsprozesses angesehen werden. Als weitere Differenzierungsmarker wurde die Aktivität von ALP (als Marker für Mineralisierungsprozesse) und die Expression der Gene OPN, Runx2, Osx, TGF-β1 untersucht. Der Differenzierungsprozess läuft in Richtung der reiferen osteozytären Zellstadien in direkter Verbindung mit der Ausbildung einer mineralisierten Matrix ab. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass murine Vorläufer- Osteoblastenzelllinien in einem Zeitraum von 21 Tagen nach Bestrahlung einen erhöhten Anteil differenzierter Zellen aufweisen. Mit diesen Beobachtungen geht die vermehrte Expression von Zellzyklus-Inhibitoren einher. Dies könnte ein wichtiger Beitrag für die genomische Stabilität der untersuchten Zelllinien bedeuten.