Identifizierung und Produktion geeigneter Proteinstrukturen für die Entwicklung einer Aptamerbasierten Detektionsmethode für bakterielle Erreger

Kurzfassung

In Hinblick auf das zunehmenden Interesse an effizienten und spezifischen Detektionsverfahren für bakterielle Erreger verfolgte die vorliegende Arbeit das Ziel der Entwicklung eines Aptamer-basierten Detektionssystems unter Verwendung spezifischer oberflächen-exponierter Proteine als Identifikationsmarker. Grundlage dieses Systems stellt die Identifizierung und Bereitstellung genannter Zielproteine in ihrer nativen Form für eine darauffolgende Aptamer- Synthese dar. In der vorliegenden Arbeit wurden daher Oberflächenproteine pathogener Erreger bioinformatisch analysiert und eine Auswahl dieser als trunkierte Form heterolog in E. coli produziert, um die Basis des angestrebten Aptamer-basierten Detektionssystems zu legen. Die bioinformatische Analyse erfolgte exemplarisch für die Organsimen V. cholerae, B. anthracis, M. tuberculosis, L. pneumophila, C. burnetii sowie P. aeruginosa, welche sich aufgrund ihrer gesundheits- und oder sicherheitsrelevanten Aspekte für die Öffentlichkeit als besonders relevant auszeichnen. Innerhalb der Analyse wurde deutlich, dass eine Vielzahl potenzieller Oberflächenproteine in den untersuchten Pathogenen zu finden ist, allerdings lediglich ein Teil dieser Kandidaten die erforderlichen Kriterien, wie einer ausreichenden Oberflächenexposition, Spezifität und konservierten Strukturmerkmalen, die für einen effizienten und spezifischen Nachweis im Rahmen des geplanten Aptamer-basierten Detektionssystems entscheidend sind, erfüllten. Anhand genannter Ausschlusskriterien wurden neben weiteren möglichen Kandidaten, schließlich die Oberflächenproteine VolA für V. cholerae, BclA für B. anthracis und LipY, LprI sowie PecA als potenzielle Strukturen für M. tuberculosis identifiziert. Auch L. pneumophila, C. burnetii und P. aeruginosa zeigten innerhalb der Analyse Proteine auf, die sich als potenzielle Kandidaten weiterführender Produktionen auszeichnen. Die heterologe Produktion erfolgte für die Proteine VolA, aus V. cholerae, BclA, aus B. anthracis, sowie den drei M. tuberculosis Proteinen LipY, LprI und PecA. Sowohl VolA als auch BclA konnten in ihrer trunkierten Form erfolgreich innerhalb beider Vektor- und Aufreinigungssysteme exprimiert werden und zeigten hohe Reinheiten, die eine essenzielle Voraussetzung der Aptamer-Synthese darstellt. Dabei konnten maximale Ausbeuten von nahezu 16 mg L-1 Kultur für sBclA und 15 mg L-1 Kultur für sVolA ermittelt werden. Hingegen erwies sich die Produktion der mycobakteriellen Proteine als Herausforderung und wird auf die Bildung möglicher Einschlusskörper zurückgeführt. Ein Einsatz verschiedener Strategien, darunter die Nutzung Organismus naher Verwandter, wie M. smegmatis, erschient hierbei als vielversprechender Ansatz für ihre Produktion. Anhand der vorliegenden Arbeit konnten die ersten Grundlagen zur Entwicklung eines Aptamerbasierten Detektionssystems gelegt werden. So können aufbauend auf den Ergebnissen der rekombinanten Proteine VolA und BclA erste Selektionen spezifischer Aptamere erfolgen, die den Grundstein des Systems bilden. Die Identifizierung dargestellter Oberflächenproteine kann für zukünftige Produktionen verwendet werden und damit ein breiteres Spektrum der Detektion pathogener Organismen innerhalb des Detektionssystems abdecken.