Etablierung und Optimierung einer nukleären Transformation von Euglena gracilis

Kurzfassung

In dieser Arbeit konnte eine nukleäre Transformation von Euglena gracilis mithilfe des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens nachgewiesen werden. Die durchschnittliche Transformationseffizienz betrug für den binären Vektor pCAMBIA1304 11,48 % +/- 5,6 % und für den Vektor pWEN650 8,26 % +/- 4,9 %. Nachgewiesen wurde die Insertion des Transgens in das Genom von Euglena gracilis durch eine Southern-Blot-Analyse mit einer Probe gegen das Gen für eine Hygromycin-Resistenz, sowie eine Polymerasekettenreaktion gegen die Transgene für Hygromycin, GUS, GFP und den CaMV-35S-Promotor. Nach einigen Vorversuchen, bei denen die verschiedenen Transformationsparameter an Euglena gracilis-Wildtypzellen getestet wurden, konnte ein optimiertes Transformationsprotokoll etabliert werden. Dieses Protokoll, welches auf einer Blau-Färbung positiv transformierter Zellen durch einen GUS Assay beruht, sieht eine Ko-Kultivierungszeit von 48 Stunden in EM Medium, pH 6,5 bei 19 °C vor, einer Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 optischen Dichte von 1 und einer optischen Dichte von Euglena gracilis von 2. Ein weiteres Experiment, basierend auf dem GUS Assay, konnte zeigen, dass schon eine 30-minütige Ko-Kultivierung der Zellen mit dem Agrobacterium tumefaciens zu positiv transformierten Zellen führte. Die Veränderung der Genexpression konnte mit der digital droplet PCR ermittelt werden. Weiterhin wurden drei verschiedene Promotoren auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Genexpression inserierter Gene zu induzieren. Hierbei konnte gezeigt werden, dass der CaMV-35S-Promotor mehr positiv transformierte Zellen hervorbringen konnte als der Chlamydomonas reinhardtii RbcS2 oder der β-Tubulin-Promotor. Die langanhaltende Stabilität der Transgeninsertion konnte für den Vektor pWEN100 gezeigt werden. Transformierte Zellen wurden in EM-Medium mit dem Antibiotikum Hygromycin gezüchtet und alle vier Wochen in neues Medium mit oder ohne Antibiotikum überführt. Diese Zellen wachsen seit zwei Jahren in Medium mit dem Antibiotikum Hygromycin, während Wildtypzellen nicht anwachsen können. Toleranzstudien konnten außerdem zeigen, dass Zellen, die mit dem Vektor pWEN100 transformiert wurden, eine Antibiotikum-Konzentration von bis zu 500 µg/mL tolerieren konnten. Diese nukleäre Transformation von Euglena gracilis bedarf aber noch vieler Optimierungen, da die Genexpression bei anderen Vektoren wie z.B. pCAMBIA1304 und pWEN650 bereits nach zwei Wochen herunterreguliert wird. Hierfür müssen noch Verbesserungen und Lösungen gefunden werden, um das Gen-Silencing zu unterdrücken und dadurch eine stabile und anhaltende Expression des Transgens zu gewährleisten. Eine optimal funktionierende Transformation von Euglena gracilis könnte nicht nur für die Analysen der Signaltransduktionsketten genutzt werden, sondern auch für biotechnologische Ansätze in der Pharma-, Lebensmittel- und Agrarindustrie. Auch würde dies der Weltraumforschung von großem Nutzen sein, da Euglena gracilis schon mehrfach als Sauerstofflieferant in bioregenerativen Lebenserhaltungssystemen eingesetzt wurde. Basierend auf der Einbindung des Einzellers in solche Lebenserhaltungssysteme und dessen Fähigkeit, auf Schwerkraft bzw. Schwerelosigkeit zu reagieren, war es eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit, verschiedene Vorversuche und Stabilitätstests für eine automatische Genexpressionsanalyse von Euglena gracilis in einem Kompaktsatellitenprojekt zu etablieren. Diese Genexpressionsanalyse basierte auf einer automatischen RNA Isolation mit magnetischen Beads, gefolgt von einem Microarray. Zur Lyse der Zellen wurde der RLA-Puffer, gemischt mit dem RNA-Stabilisator DTT, verwendet. Die freie mRNA wurde schließlich an Dynabeads Oligo (dT) magnetische Beads gebunden und mit zwei verschiedenen Waschpuffern gereinigt, um Proteine und Zelltrümmer zu entfernen. Daraufhin konnte die mRNA in cDNA umgewandelt und zur weiteren Analyse an Microarrays gebunden werden. Um sicherzustellen, dass die magnetischen Beads im Kompaktsatelliten bei den dort herrschenden und von den Herstellern der Reagenzien abweichenden Bedingungen funktionsfähig bleiben, wurden zwei verschiedene Stabilitätstests durchgeführt. Für den RLA-Puffer, gemischt mit DTT, konnte eine gleichbleibende Aktivität von bis zu 450 Tagen nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde eine Mischung von RLA-Puffer, DDT und Beads getestet, und es konnte bestätigt werden, dass auch die Beads ihre Fähigkeit, mRNA bei Raumtemperatur zu binden, für 360 Tage behalten haben. Um Euglena gracilis-Zellen im Weltall untersuchen zu können, müssen diese zunächst unbeschädigt dahin befördert werden. Hierfür hat sich die Lagerung der Zellen auf Baumwolle in geringen Mengen an Medium als zweckgemäß erwiesen. Dadurch sind die Zellen in einer Art Überdauerungszustand (Resting-State), in welchem sie mehr als neun Monate überleben können, um dann schließlich mit Medium wieder reaktiviert zu werden. Molekularbiologische Untersuchungen von Dauerstadien haben gezeigt, dass sich eine Stunde nach der Rehydrierung fünf von 21 Genen signifikant verändert hatten. Darunter sind die Hitzeschock-Proteine HSP70 und HSP90, Ubiquitin, Frequenin und die Proteinkinase A. Nach zwei Tagen waren fast keine Unterschiede mehr in der Genexpression zu sehen, was für eine Wiederherstellung des ursprünglichen Zellmetabolismus spricht. Für diese Genexpressionsanalyse wurde eine Multiplex-PCR verwendet, in der 22 Euglena gracilis-spezifische Gene parallel in einer Reaktion analysiert werden können.